Ein Rettungsanker für undichte Lungenzellen

Undichte Lunge sind eine sehr häufige Nebenwirkung von Herzinsuffizienz, aber alle zur Zeit verfügbaren Drogen zu tun ist, reduzieren Sie die Menge der Flüssigkeit in den Körper, anstatt das Leck abzudichten selbst. Eine neue Gentherapie erstellt am Wyss Institute und der Boston-Kinderklinik getestet und in menschlichen Lungen-Chips blockiert die mechanische Funktion des ein-Kanal-protein eine Rolle bei Lungen-Leckage beim verlassen seiner chemischen Funktionen intakt, mit einem neuen potenziellen klinischen Ziel für Lungenödem mit minimaler Toxizität.

Über 80% der Patienten mit Herzinsuffizienz zu entwickeln Lungenödem—das austreten von Flüssigkeit aus der Lunge Blutgefäße und in der luftgefüllten Alveolen. Dieser Zustand reduziert die Menge an Sauerstoff, die Lunge aufnehmen kann, die verhindern, dass Patienten zu tun, die alltäglichen Aktivitäten und sogar tödlich sein. Es gibt keine Medikamente, die derzeit zur Verfügung, um direkt zu behandeln, die Auslaufen, wenn es beginnt; die am häufigsten verschriebenen Medikamente einfach, den Blutdruck senken oder die Menge der Flüssigkeit in den gesamten Körper in einem Versuch, reduzieren die Schäden.

Nun, ein Projekt, ein Jahrzehnt in der Herstellung, an der Wyss Institut für Biologisch Inspirierte Engineering an der Harvard University und Boston Children ‚ s Hospital (BCH) hat identifiziert, die eine molekulare Weg, könnte ein Weg zum Ziel Lungenödem selbst mit minimalen Nebenwirkungen. Der Vorstoß basiert auf die Technik des adeno-assoziierten virus (AAV) – Vektoren als gen-Therapie-delivery-Systeme, deren Ziel die Lungen und Untersuchungen mit primären humanen Lungenzellen in einer Lungen-Alveole-Chip. Die Forschung berichtet in APL Bioingenieurwesen.

„Lungenödem ist ähnlich wie ein Leck in einer Wasserleitung. Die effektivste, was zu tun ist, um das Leck abzudichten, aber die aktuellen Medikamente auf dem Markt arbeiten, zum absperren der Wasserversorgung insgesamt und hoffe, dass das Leck behebt sich von selbst,“ sagt der erste co-Autor Ratnakar Potla, Ph. D., M. B., B. S., eine wissenschaftliche Mitarbeiterin, die zuvor in der Vaskulären Biologie-Programm an BCH und jetzt am Wyss-Institut. „Mit unserer Methode können wir genau das Ziel, das Leck, die eine viel mehr effiziente Art und Weise, das problem anzugehen.“

Ein off-target-target

Das team fokussierte Ihre Untersuchung auf einem bestimmten Kanal proteins in den Membranen der Lungenzellen reguliert den Fluss von Substanzen zwischen der Lunge die Alveolen (Lungenbläschen) und Blut Schiffe, genannt TRPV4. Dieser Kanal ist bekannt, die aktiviert werden, durch physikalische Kräfte, wie die Bewegung der Atmung. Seine mechanosensitive kann auch dazu führen, ein problem, jedoch bei Patienten mit erhöhten Druck in Ihrer Lunge, Blutgefäße, oft hervorgerufen durch eine Sicherung der Flüssigkeit, wenn das Herz kann nicht mehr Pumpen effektiv. Der körperlichen Belastung vermittelt auf TRPV4 aktiviert es, wodurch das Lungengewebe zu werden „undicht“, was wiederum übt mehr Druck auf die umliegenden Blutgefäße, so dass ein Teufelskreis feedback-Schleife, verschlechtert sich die pulmonale ödeme.

Medikamente wurden entwickelt, um Herunterfahren TRPV4 chemisch durch die Blockierung aller channel-Aktivitäten, darunter ein Kandidat von GlaxoSmithKline derzeit in einer klinischen phase-III-Studie. Aber TRPV4-Aktivität spielt eine wichtige Rolle in viele andere Prozesse des Körpers, wie Knochen-remodelling und Blase Ton, so dass seine vollständige Inaktivierung kann zu unerwünschten Nebenwirkungen und toxizitäten, begrenzen Sie die Menge der Droge geliefert werden kann.

Um dieses problem zu umgehen, die Wyss und BCH Forscher konzentrierten sich auf ein anderes Membranprotein, CD98hc, die verantwortlich ist für die übertragung der mechanischen Kräfte auf den TRPV4-Kanal. In separaten Studien, fanden Sie, dass die überexpression einer bestimmten region des CD98hc protein (hohe Homologie oder HH-Domäne) verhindert, dass die mechanische Aktivierung von TRPV4, so dass das team stellte die Hypothese auf, dass eine gen-Therapie liefern, dass die region von der protein-Lungen-Zellen könnte eine wirksame Behandlung für vaskuläre Leckage in der Lunge führt zu einem Lungenödem.

Um zu testen, ob die Theorie, die Sie erstellt Gentherapie-Konstrukte mit verschiedenen Serotypen von AAV als Lieferwagen mit der genetischen Sequenz, die codes für das HH-Domäne des CD98hc protein. Dann testeten Sie, wie gut die Konstrukte geliefert, die Ihre Fracht in das Erbgut von menschlichen Lungen alveoläre Epithelzellen und primären humanen mikrovaskulären Lungen-Endothelzellen—die Zellen-Typen, die bilden die Schnittstelle zwischen Luft und Flüssigkeit Räume in der Lunge. Sie identifiziert AAV2.5T als der vielversprechendste Serotyp, als könnte es erfolgreich zu infizieren und fahren gen-expression sowohl in den epithelialen und endothelialen Zellen.

Entscheidend ist, dass die Zellen, die vermehrt die HH-Domäne von CD98hc angezeigt fast vollständige Hemmung der mechanisch-aktivierte calcium-Signal durch TRPV4, während ein Medikament, das stimuliert TRPV4 chemisch wiederherstellen kann dieses Kalzium-signaling response—Beweise, dass die Gentherapie blockiert TRPV4 mechanischen Signalweg, während die übrigen Funktionen intakt.

Das Stopfen des Lecks

Die Forscher ausgewertet, die Wirkung der überexpression des HH-Domäne in einer menschlichen Lungen-Alveole Chip zuvor entwickelt, die am Wyss-Institut als klinisch Relevantes Modell für eine menschliche Lunge. Der Mikrofluidik-chip enthält zwei parallele Kanäle, getrennt durch eine durchlässige Membran, gefüttert mit einem primären menschlichen Lunge alveolären epithelialen Zellen und perfundierten mit Luft, die andere mit human lung endothelial Zellen und perfundierten mit flüssigem medium. Zur Simulation der physikalischen Kräfte vermittelt an den Zellen durch die Atmung Bewegungen, die chips sind zyklisch gedehnt und entspannt mit Absaugung. Das team beobachtet, dass, wenn die chips‘ air Kanäle wurden mit Flüssigkeit gefüllt, die für vier Stunden zur Simulation der pulmonalen ödembildung, die Barriere zwischen den chips “ Luft und liquid Fächer kompromittiert wurde, und die chips konnte nicht wiederherstellen, auch nachdem die Flüssigkeit entfernt wurde.

Wenn Sie eingeführt Ihre Gentherapie-Vektor in chips, sahen Sie, dass die Leckage wurde stark reduziert und die Barriere Stärke des Lungen-Zellen blieben intakt, auch wenn nach der physischen Belastung, die Nachahmung von Bewegungen Atmung. „Bemerkenswert ist, sahen wir eine deutliche Verbesserung in der Lungenfunktion, obwohl nur etwa 30% der lungenepithelzellen und 10% der vaskulären Endothelzellen wurden erfolgreich transfizierten mit der gen-Kodierung für das HH-Domäne von CD98, was darauf hinweist, dass diese Strategie ist extrem schützende“, sagte co-Autor Rachelle Prantil-Baun, Ph. D., Senior Staff Scientist am Wyss-Institut.

Um zu bestimmen, wie die Blockierung der mechanischen Aktivierung von TRPV4 bietet diese schützende Wirkung, die die Forscher analysierten die Zellen in den Lungen-Alveole Chip mittels Fluoreszenz-imaging. Sie sah, dass Untertauchen die Luft Kanal in fluid ohne die Anwendung der gen-Therapie führte zu Brüchen in der Zell-Zell-junctions, die helfen, die Integrität der Luft-Flüssigkeits-Schranke, während diese verbindungen intakt geblieben sind, in behandelten Zellen mit dem gen-Therapie.

Interessanterweise fanden Sie auch, dass die Transfektion mit der HH-Domäne änderte sich die Endothelzellen Verhalten: in der Erwägung, dass diese Zellen in der Regel ordnen sich so, dass Sie senkrecht zur Richtung der physikalischen Kraft, die auf Sie angewendet, die mit dem AAV-geliefert-gen nicht. Als Ergebnis der population von Zellen wurde stabiler, die Erhaltung der Zell-Zell-verbindungen, was auf einen Mechanismus, durch die Undichtigkeit verhindert wird. Die Hoffnung ist, dass diese Erkenntnisse können genutzt werden, um die Entwicklung spezifischer mechanotherapeutic Medikamente für die gezieltere Behandlung von Lungen-ödem in der Zukunft.